旧岁已展千重锦，新年再进百尺竿，在春节来临之际，交弘生物再一次在医疗行业中大放异彩，一篇关于《探索新型可编程性分子诊断工具酶开发新策略》的文章在中国医药报中第6768期刊出。
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新冠肺炎疫情暴发初期，国内外多家科研院所和研发企业基于自身在传染病病原分子检测方面的技术积累，借助PCR技术、等温扩增技术、靶向NGS技术、宏基因组测序技术，以及基于新型基因编辑酶开发的CRISPR/Cas核酸快检技术等，多管齐下开发病毒核酸快检试剂盒，为病原体鉴定提供解决方案。在新冠肺炎疫情防控常态化的当下，这些分子诊断技术仍发挥着重要作用。
分子诊断是当代检验医学的前沿领域之一，用于传染病、遗传病、肿瘤等疾病的早期诊断及伴随诊断，也为疾病治疗提供了参考和指导。回顾分子诊断技术发展史，不难发现，每一次技术迭代在很大程度上都得益于新功能酶的发现和应用，如等温扩增聚合酶和CRISPR/Cas系统等，推动分子诊断技术的各项性能指标不断优化。然而，这些分子诊断用酶及检测技术多源自欧美等发达国家和地区，且在对体液中痕量SNV、SNP、病原体等检测时灵敏度有限。在新冠肺炎疫情暴发初期，严重依赖进口酶制剂等“卡脖子”技术困境尤为突出。因此，开发具有中国自主知识产权的新型酶制剂及相应的高灵敏度检测技术，将为我国分子诊断行业提供更安全的战略保障。
创新酶前瞻研究迫在眉睫
新冠肺炎疫情还在持续，对体外诊断（IVD）行业影响深远。全球一体化体系遭遇挑战，产业供应链面临前所未有之困局；国内药品、医用耗材集中带量采购趋势不可逆转，成本压力逐级传导。在此背景下，一方面，核心关键原材料行业发展成为关注焦点，保证关键原材料不受制于人，彻底解决“卡脖子”问题，是IVD上游科研工作者和产业人员共同努力的目标；另一方面，在新冠肺炎疫情防控常态化的当下，如何改变我国现阶段创新酶“跟跑”国外企业的现状，助力民族企业技术升级和创新发展，也是我国蛋白质工程技术科研人员的职责所在。
酶是生物体内复杂化学反应体系的执行者，其催化多样性、高效性和精准性确保了生命体有序运转，也为现代生物产业提供了生物催化剂；微生物多样性更是为新型生物催化、合成生物学元件募集提供了丰富资源。近年来，越来越多可高效设计、可编程性核酸酶被发现。例如，基于锌指核酸酶、转录激活样效应因子和CRISPR派生的RNA-guided工程蛋白质 (如dCas9、Cas12a、Cas13和Cas14系列核酸酶)及高温Argonaute（Ago）核酸酶。这些嵌合核酸酶通常由两部分组成：一个可编码的序列特异性DNA/RNA结合模块和一个DNA/RNA切割结构域。
目前，基于这些可编程性核酸结合蛋白的细胞治疗等生物技术应用已引起人们的广泛关注，如与核酸酶结构域融合，诱导特定靶点DNA双链断裂；与转录激活效应蛋白结构域融合，人工控制基因表达等。此类可针对任意核酸序列设计并检测的工具酶在分子诊断领域中具有巨大的潜力。
上海交通大学分子酶学与合成生物学研究团队长期从事分子酶学工程研究，发现酶分子的精密性结构对其功能具有重要意义，理解酶分子进化规律有助于构建“三高”（高活性、高稳定性和高特异性）生物催化剂。该团队设计构建的新型氨基转移酶、糖苷酶以及多酶组装体，为药物合成（如伏格列波糖）、环境保护（如农药检测）等方面的难题提出了新的解决方案，推动了生物技术领域的发展。
核酸酶在分子诊断领域应用的发展脉络，大体可概括为从聚合酶，连接酶，水解酶（剪切酶），到可编程性的、人为可控的、特异性更高的工程酶。自2016年起，上述团队开始关注分子诊断领域，同时敏锐地察觉到核酸酶的发现、表征及应用进入了一个新格局。研究发现，新型可编程性核酸酶与已有酶的体系兼容性更高，可改善和提升现有技术体系，核酸酶体外检测应用的春天即将来临。
Ago酶核酸检测系统突破技术壁垒
目前，通用的荧光PCR方法由于灵敏度有限、检测时间相对较长及对检测设备要求较高等，不能完全满足临床的早诊及随诊要求。CRISPR/Cas系统在病原体检测和基因分型、癌症突变检测等核酸诊断领域的应用引起了人们对下一代分子诊断技术的关注。然而，基于CRISPR系统的核酸检测技术仍受到许多限制。多重检测难以实现、crRNA设计相对复杂且合成价格昂贵等种种因素，使该技术难以进入市场。
原核Ago蛋白具有核酸内切酶催化特性，通过结合小RNA/DNA作为guide序列，能够在target序列上特定位置的碱基位点进行高效、精准切割。极端嗜热微生物的Ago蛋白能够在近95℃的高温条件下表现核酸酶活性，即能够对guide-靶标互补配对的特定位置进行切割。与目前在基因编辑领域炙手可热的CRISPR技术相比，Ago蛋白进行核酸剪切不需要借助其他特定序列，拓宽了靶位点的选择范围，显示了其在基因编辑、基因诊断及遗传疾病治疗等分子生物学和医学领域的应用潜力。
上述团队对嗜热古菌Ago蛋白功能多样性及酶学机制开展系统研究，揭示了不同来源 Ago蛋白的核酸选择性机制，发现了高温Ago蛋白对单碱基差异靶标序列精准识别的规律，并设计开发了新型核酸检测技术。通过系统引入引导链的错配碱基，发现连续碱基错配10～11位剪切位点的可编程核酸酶——Pf Ago对单碱基靶标区分、剪切效果更佳。在上述工作基础上，该团队率先建立了基于高温Ago核酸酶的高灵敏度、高特异性的基因检测平台，形成了多项具有我国自主知识产权的核酸检测新技术及相关专利池。
低丰度基因富集及检测技术A-Star（Argonaute-directed Specific targe tenrichment and detection）可实现常规PCR体系内Ago酶与guide DNA复合物专一性识别、剪切野生型基因片段，低丰度突变型DNA不被剪切且伴随PCR过程得到扩增，进而实现偶联PCR体系的低丰度突变基因（如癌基因等）富集检测。A-St ar技术灵敏度可以达到0.01%，样本DNA入口量低至aM（10-21摩尔）浓度。该技术不仅可偶联Taqman探针法、Sanger测序及NGS等进行直接检测，还可结合多终端检测方法，如核酸质谱法、数字微流控芯片等，形成一体化低丰度突变基因的检测方法，可针对基因SNV、SNP分型及缺失、增加等多类型低丰度核酸标志物开发核酸检测新产品。
病原体感染快速检测技术RADAR（Renewedg DNA Assisted DNA cleavage with Argonaute）是通过该团队首次发现的Ago次级剪切机制，实现guide DNA介导的、靶向特定病毒核酸序列的精准检测手段。该技术可用于多病毒、病原菌快速分型及检测。
可编程性Ago核酸检测系统作为新一代分子诊断技术，在核酸富集和检测方面均可实现模块化设计，兼容并提升现有基因检测技术（如PCR技术、测序技术、核酸质谱及分子杂交技术等）的性能。低丰度基因富集及检测技术A-STAR可应用于SNV、SNP分型等多类型低丰度突变基因快检试剂开发；高灵敏性核酸快检技术RADAR可应用于多种潜伏感染病原体的快检和分型检测。两项平台技术具有设计简便、高灵敏度、快速及多重检测等优势，将为医疗领域（医学基础研究、生殖健康、肿瘤筛查、遗传病检测、慢病预防和管理等）和非医疗领域（司法鉴定、农牧业育种、动植物保护、动物疫病检测和监测、生物安全等）提供基因检测新方案。
目前，基于上述新技术的在研产品主要围绕肿瘤（如肺癌、结直肠癌、肝癌及乳腺癌等）检测，新冠病毒、流感病毒等呼吸道多病毒核酸检测以及常见遗传性疾病的检测，并已陆续启动相关试剂盒的研发和申报程序。
A-STAR和RADAR两项底层技术将有望覆盖多病原、多场景的核酸检测应用，突破当前低丰度核酸检测技术壁垒，有助于解决检测用酶及平台技术开发方面的“卡脖子”问题，具有重要的工业开发价值和广阔的市场应用潜力。
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