3月以来，我国新一轮的本土疫情已经波及31个省份，奥密克戎隐匿性强、传播速度快，为尽快打赢这场疫情阻击战，很多地方都在与病毒赛跑，进行着一轮又一轮的核酸检测。上海本轮疫情存在爆发潜在风险，抗疫争分夺秒。那么，减少人员流动以降低感染风险，同时减轻医检单位的压力，核酸快检或将成为最有效的新冠检测方式之一。
核酸检测在新冠等传染性疾病诊疗中发挥着重要作用, 目前对高灵敏度、快速、居家检测的需求尤为迫切，以解决专业人员短缺、检测结果等候时间长和检测可靠性低等问题。近年来，CRISPR为代表的基因编辑酶（Cas12/13）核酸检测技术，解决了核酸检测中的假阳性、可视化等问题，被誉为“下一代分子诊断技术”，然而该体系存在引导链RNA合成昂贵且易降解、多重检测反应体系复杂等诸多问题，限制了其临床应用。
近期美国陆续上市了几款核酸自检产品，如Cue health、Lucira、Detect等公司发布的产品，检测灵敏度大幅优于抗原试纸条，可以在病毒感染及转阴的全周期进行检测，但销售价格昂贵，很难在普通民众中普及。此外，已经发布的核酸自检产品也有核酸扩增产物再次产生污染的风险，干扰周边其他人的检测结果。国内也有类似的核酸快检产品正在开发。交弘生物原创平台技术更趋于产业化产品化，有望助力基层核酸快检。这种基于传统PCR管材的一管式核酸快检试剂既利用了耗材的通用便捷性，又以极简化的试剂封闭的方式避免了开盖和气溶胶污染潜在的风险，扩增产物终点降解的现象也降低了对核酸检测环境的依赖，有望实现非PCR环境下的核酸快检，核酸检测出结果后，技术上可实现同步上传数据结果，适用于居家检测、公共场所快检、社区筛查等应用场景。
近日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室冯雁团队在分子诊断领域权威期刊《Biosensors and Bioelectronics》上发表题为“Argonaute-integrated isothermal amplification for rapid, portable and multiplex detection of SARS-CoV-2 and influenza viruses”的研究论文。该工作利用高温菌Argonaute（Ago）基因编辑酶的级联剪切机制，结合快速等温扩增，建立了新型多重快速核酸检测平台技术—MULAN (Multiplex Argonaute-based Nucleic Acid Detection)，实现了新冠及流感病毒样本的高灵敏度、高特异性、快速的便携式检测。上海交通大学生命科学技术学院博士生叶星宇为该论文第一作者，冯雁教授、许四宏研究员、刘倩副研究员为共同通讯作者。研究工作由上海交通大学、中国食品药品检定研究院、浙江科技学院、人和未来生物科技有限公司、万孚生物技术股份有限公司、上海交通大学附属瑞金医院等合作完成。
Ago是一种靶向剪切DNA的基因编辑酶，它采用短DNA引导链（guide DNA，gDNA）对互补靶标链进行特异性剪切。冯雁团队发现高温Ago具有级联剪切活性，即在初始gDNA指导下的剪切产物可进一步指导互补ssDNA的剪切。相比于Cas12/13的反式剪切，Ago酶可依靠特异性gDNA序列精准识别多个靶标基因，实现单酶多基因靶向剪切，更适合于核酸多重检测和突变检测。
基于以上研究，面对现有新冠核酸检测技术的瓶颈与挑战，该文章提供了四方面的突破与进展：
建立了等温扩增-Ago剪切偶联体系，通过Ago对扩增产物的精准级联剪切，解决了等温扩增中非特异性产物造成的假阳性问题。
通过设计特制反应耗材和配套小型等温荧光检测仪，实现了扩增-剪切“一管式”便携式检测，简化了操作步骤，避免了核酸气溶胶污染。
结合胶体金免疫层析技术和蓝光激发荧光效应，建立了高灵敏的可视化新冠病毒核酸快检，为居家核酸检测提供可行方案。
建立了新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒的多重检测体系，临床样本检测的结果与实时荧光PCR方法一致；同时，基于gDNA单碱基差异影响Ago剪切效率的特性，实现了对SARS-CoV-2与其突变毒株的区分检测。
研究人员首先利用了环介导等温扩增（LAMP）的快速等温的特点，以SARS-CoV-2为研究对象，在ORF1ab基因的保守区域设计并筛选出一组灵敏度较高的LAMP引物，获得扩增产物；随后，设计两条与扩增产物DNA一条链互补的间隔16 nt的gDNA以及一条与剪切产物互补的荧光信标分子（两端分别标记荧光基团和淬灭基团），两条gDNA引导Ago对扩增产物进行初级剪切，并形成16 nt的ssDNA剪切产物用于引导对荧光信标分子的次级剪切，从而释放荧光信号（图1a）。在优化了缓冲液、金属离子、gDNA、酶浓度、反应时间等条件后，实现了LAMP与Ago剪切的体系兼容，解决了LAMP非特异扩增造成的假阳性问题。为避免两步法检测的中途开盖造成的气溶胶污染，研究团队在反应管中嵌入了一个特制的内衬管，将扩增与酶切反应体系分开。扩增结束后，只需瞬时离心或用手甩动即可将扩增产物与酶切体系混合，无需开盖。同时，配套小型的恒温荧光检测仪，实现了扩增剪切“一管式”便携式检测（图1b）。整个反应时间控制在45分钟左右，较RT-qPCR时间（反转录+40个循环约80分钟）更短，最低可检出1.6 拷贝/反应 (320 拷贝/毫升)的病毒RNA样本（图1c）。研究人员首先应用了胶体金免疫层析技术，在试纸条的C线固定了抗FITC/ FAM抗体，T线固定了抗鼠抗体，同时荧光信标分子两端分别标记FAM和Biotin（生物素），在结合垫中荧光信标分子Biotin端会与金标（胶体金颗粒标记）鼠抗Biotin抗体结合。当探针未被剪切时保持完整时（无靶标扩增产物），荧光信标分子由于FAM端与抗FAM抗体结合被C线拦截，形成胶体金聚集显色；当探针被剪切为两端时（有靶标扩增产物），荧光信标分子的FAM被C线拦截，携带胶体金的Biotin端则继续流向C线并被抗鼠抗体拦截显色（图2a）。该方法可直接通过肉眼观察判定检测结果，灵敏度为15拷贝/反应（相当于Ct值为35左右）（图2b）。此外，研究人员还利用了蓝光激发荧光效应，可实现光源照射下（例如蓝光手电筒）的肉眼可视化判定（图2c）。MULAN可视化核酸检测灵敏度相比较抗原检测试纸条（灵敏度：Ct值＜30，哥本哈根大学对全球46种新冠抗原检测产品测试报告）大幅提高，在核酸居家自检中的应用潜力十分巨大。图2. MULAN胶体金层析试纸条及蓝光照射可视化检测
研究人员还针对新冠病毒单碱基突变株设计了高效的分型检测方法。以新冠病毒及其D614G突变株为对象，巧妙地在荧光报告基因上引入单点错配，提高Ago的靶标精准识别能力，实现了区分野生型和突变毒株的分型诊断（图3a）。在野生型和突变株基因不同混合比例的样本测试中，MULAN可检出5%的突变频率，即可区分20：1混合样本中有一份的突变病毒，具有高度特异性（图3b）。图3. MULAN单碱基突变的检测原理及不同突变频率样本的检测结果
研究人员随后以SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒为检测对象，优化三组不同引物之间的组合配比，通过设计三组不同的特异性gDNA与探针，建立MULAN多重检测平台技术（图4），实现了单酶对多重等温扩增产物的精准识别。用所建立的方法，对不同浓度的SARS-CoV-2假病毒以及33例经qPCR检测试剂盒检测为甲流或乙流阳性的临床样本进行检测，假病毒最低检测浓度可达100 拷贝/毫升（图5a），甲流和乙流临床样本检测符合率为100%（33/33）（图5b）。图5. MULAN SARS-CoV-2假病毒、流感临床MULAN检测平台技术为病原体多重核酸检测领域提供了一种极具前景的解决方案。与现有的检测技术相比，它具有快速、准确、经济的优势，尤其是多重检测的简便性和安全性优于目前报道的CRISPR检测技术（表1）。此外，MULAN技术与恒温检测设备、检测试纸及蓝光照射等结合，降低了对昂贵仪器设备（qPCR仪等）的依赖，其便携性为新冠等传染性疾病的居家检测、急门诊和基层检测等提供了新方案。研究成果不仅对传染病诊疗产生积极影响，也将对重大疾病防控提供理论和技术支撑。合作单位交弘生物科技（上海）有限公司承担相应技术转化及产品开发。1.Patchsung, M. et al. Nat Biomed Eng 4, 1140-1149, doi:10.1038/s41551-020-00603-x (2020).
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本研究得到了国家自然科学基金面上项目（31770078）、科技部重点研发计划（2020YFA0907700）、上海交通大学“交大之星”计划医工交叉研究基金（20X990010002）和浙江大学防治新型冠状病毒肺炎应急科研项目（2020XGZX022）的支持。
冯雁教授团队聚焦分子酶学和合成生物学研究。近年来针对疾病分子诊疗方面的酶学需求，探索了微生物Agonaute 核酸酶的催化特性与进化相关性，揭示了酶对单碱基差异靶标序列精准识别的规律，创建了具有自主产权的肿瘤核酸富集和检测“A-STAR”（Nucleic Acids Research, 2021, 49(13), e75）、病原微生物核酸检测“RADAR”（Bioresources and Bioprocessing, 2021, 8, 46）等系列新技术，突破了对国外CRISPR酶检测技术的依赖性，为保障人类健康、食品安全、动物检疫等行业发展提供理论和技术支撑。
论文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322002093?dgcid=coauthor
文章转自小桔灯网
上海交大冯雁团队开发丨具有自主知识产权的新型基因编辑病毒核酸快速诊断技术平台
