JHSD024非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测试剂盒(恒温扩增-实时荧光法)

非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）说明书

【产品名称】非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）

 【包装规格】48头份/盒

 【货号】 JHSD024

【用途】

本试剂盒用于拭子、血清、环境和分泌物样本中，非洲猪瘟病毒核酸的定性检测。检测结果仅供参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）是引起猪的一种急性、热性、高度致死性传染病的 DNA 病毒，根据P72基因C末端的478bp碱基对的片段扩增、核苷酸序列测定、系统发育分析，可将ASFV分为24个基因型，但是，由于病毒的变异，又发现了越来越多的基因型。非洲猪瘟是一种猪的烈性传染病，它的发病率和死亡率可以高达100%。该病一旦进入一个国家或地区，会对该区域的养猪业造成毁灭性的打击，所以世界卫生组织将该病规定为必须通报的动物疫病。非洲猪瘟主要表现包括高热、呕吐、便秘，出现这些症状以后，一般3-5天死亡。剖检可见肝、心、肾、肠、肠系膜淋巴结还有膀胱等内脏器官出血，淋巴结坏死、脾脏显著肿大。实验室诊断方法有透射电镜观察、Elisa实验和核酸检测等。

【检测原理】

本试剂盒利用环介导等温扩增技术（LAMP）耦合gDNA辅助的新型Argonaute蛋白级联剪切技术（RADAR），选取非洲猪瘟病毒（ASFV）P72基因作为靶区域，进行扩增与检测，该方法具有高特异性和高灵敏度，可对低丰度（aM浓度）非洲猪瘟病毒核酸实施高效（仅需50min）、精准、便捷的检测。检测过程设置阴性对照和阳性对照，并以猪Actin-β基因作为内参基因。

【主要组成成分】

说明：

① 核酸扩增反应液、检测液使用前保存于-20℃，4℃保存3天内检测效果无明显差异，应避免反复冻融，冻融3次不影响检测结果。

② 不同批号的组份不可以互换使用。

③ 自备试剂：核酸提取及纯化试剂，推荐选择已备案的商业化核酸提取及纯化试剂。

【储存条件及有效期】

1． 核酸扩增反应液、检测液、阳性对照避光-20±5℃储存，PfAgo微球八连管2-30℃保存，有效期6个月。采用冰袋或干冰在低温避光条件下运输；不宜在高温条件下（如高于37℃）放置超过48h；反复冻融5次不影响试剂盒检测效果，超过5次效果未验证。

2． 生产日期、有效期至：见外包装盒。

【适用仪器】

本试剂盒适用于任意机型恒温荧光检测仪、荧光PCR仪。实验室检测推荐使用ABI 7500荧光定量PCR仪，ABI QuantStudio荧光定量PCR仪，POCT检测推荐使用交弘生物科技（上海）有限公司JH-08-Ⅰ 型恒温荧光检测仪。

【样本要求】

1． 适用样本类型为拭子、血清、环境和分泌物等。

2． 操作步骤

·血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2 mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30~60 min，血液标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 g离心5 min；吸取上层血清，转移至1.5 mL灭菌离心管中，用试剂盒进行提取。

·拭子、环境和分泌物：用拭子擦拭物体表面或者蘸取分泌物样本，置于灭菌试管（含1 mL灭菌生理盐水）或病毒保存液中，密闭保存。

3． 样本采集后应及时检测，2℃～8℃保存3天内完成检测，超过3天应置于-40±5℃或以下保存12个月不影响检测结果。避免反复冻融，冻融6次不影响检测结果。

【检验方法】

1． 按照核酸提取试剂盒提取待测样本核酸。

2． 从试剂盒中取出各组分，室温融化，充分混匀后瞬间离心。

3． 计算试剂使用份数N（N=待检样本数+阳性对照数+阴性对照数），根据使用份数向试剂盒PCR八连管中加入20.0 μL检测液。

4． 吸取待检样品，阳性对照或阴性对照各5 μL，加入对应反应孔中，终体积为25 μL/管，盖紧管盖，瞬时离心。

5． PCR扩增检测

① 将PCR反应管置于PCR仪中进行扩增检测。

② 扩增参数设定

【检验结果的解释】

1． 质控标准

基线的起点值设置为1-2，基线的终点值设置为3-5(阳性对照起峰时间点前)，阈值设定为阳性对照终点荧光值的1/5-1/3区间。阴阳性对照中ROX内标的Tt值＜10 min，阴阳性对照可按下表进行判读：阴性对照Tt值（到达阈值的时间）≥10 min，且无明显S型曲线，阳性对照Tt值Tt＜10 min，如下表所示。

2． 结果判读

当阳性对照，阴性对照和检测样本的ROX内标的Tt值＜10 min符合时，检测结果有效，结果判读如下：

【检验方法的局限性】

1． 本试剂盒仅适用于规定的仪器和检测系统，检测结果仅供参考，且应结合具体病史症状综合考虑。

2． 样品检测结果与样本的收集、目的基因提取、操作环境的单一及保存质量都有关系，其中任何一步出现问题都会导致错误结果。

3． 本试剂盒用于体外定性检测非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸的检测，对于检测出的非洲猪瘟病毒（ASFV）结果不能用于区分亚型。对于检测结果为阳性的情况，可提示所检样本中存在非洲猪瘟病毒；但是，如果样本在处理过程中发生交叉污染，则可能出现假阳性结果。检测结果仅供参考，对猪的诊治应结合其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

由于试剂盒设计针对病原体核酸进行扩增检测，病原体基因都存在变异的可能，尽管选择扩增检测的保守区发生变异的

1． 可能很小，但是不能完全避免这种可能。检测结果仅供参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。

2． 如果样本中病毒载量不足，可能会导致假阴性结果，最终结果应根据临床症状和其他诊断信息进行综合判断，如有必要，请重新测试。

【产品性能指标】

1． 最低检测限：25 copies/反应。

2． 特异性：与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体（猪蓝耳病病毒、口蹄疫病毒O血清型、口蹄疫病毒A血清型、口蹄疫病毒Asia1血清型、伪狂犬病病毒、猪圆环 病毒2型）以及猪的总核酸无交叉反应。

【注意事项】

1． 检测前必须仔细阅读本说明书，并严格按照要求进行操作。

2． 本试剂盒为体外诊断试剂，操作要求一定的专业性，操作人员应当经过专业培训。

3． 本试剂盒检测的病原体核酸为DNA，操作过程中使用的所有耗材应不含DNA酶和RNA酶。

4． 实验操作必须严格分区，各区域使用的仪器、设备、耗材和工作服必须专用，不得交叉使用，避免污染。

5． 试剂盒不同批号的组份不可以互换使用，各组份使用前应室温融化，充分振荡混匀，瞬间离心后使用。

6． 反应液分装时应避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧。

7． 实验结束后，应及时清理台面，并用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯等措施进行消毒。

8． 试剂盒涉及的待测样本应视为具有传染性进行管理。

【参考文献】

1．Bastos A D S, Penrith M-L, Cruciere C, Edrich J L,Hutchings G,Roger F, Couacy-Hymann E,R Thomson G. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization. Arch. Virol,148(4);693-706(2003).

2．Guanhua Xun, Qian Liu, Yuesheng Chong, Xiang Guo, Zhonglei Li, Yinhua Li, He Fei, Kai Li and Yan Feng. Argonaute with stepwise endonuclease activity promotes specific and multiplex nucleic acid detection. Bioresour Bioprocess 8, 46(2021).

【仅供兽医诊断】